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菌落總數檢測方法

點擊次數:975  更新時間:2023-08-21

菌落總數的常規檢驗方法菌落總數的常規檢驗方法(GB4789.2-2022)。

基本操作一般包括:樣品的稀釋——傾注平皿——培養48(24)小時——計數報告。



 

(一)樣品的處理和稀釋

 


1、操作方法

(1)以無菌操作取檢樣25g(或25mlL),放于225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(瓶內預置適當數量的玻璃珠)或滅菌乳缽內,經充分振要或研磨制成1:10的均勻稀釋液。

固體檢樣在加入稀釋液后,最好置滅菌均質器中以8000~10000r/min的速度處理1min,制成1:10的均勻稀釋液。

(2)用1ml滅菌吸管或吸頭吸取1:10稀釋液1mL,沿管壁徐徐注入含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內,振搖試管混合均勻,制成1:100的稀釋液。

(3)另取1mL滅菌吸管或吸頭,按上項操作順序,制10倍遞增稀釋液,如此每遞增稀釋一次即換用1支1mL滅菌吸管或吸頭

2、無菌操作

操作中必須有“無菌操作"的概念,所用玻璃器皿必須是滅菌的。所用剪刀、鑷子等器具也必須進行消毒處理。樣品如果有包裝,應用75%乙醇在包裝開口處擦拭后取樣。

操作應當在超凈工作臺或經過消毒處理的無菌室進行。瓊脂平板在工作臺暴露15分鐘,每個平板不得超過15個菌落。

3、采樣的代表性

如系固體樣品,取樣時不應集中一點,宜多采幾個部位。固體樣品必須經過均質或研磨,液體樣品須經過振搖,以獲得均勻稀釋液。

4、稀釋液

樣品稀釋液主要是滅菌生理鹽水,有的采用磷酸鹽緩沖液(或0.1%蛋白胨水),后者對食品已受損傷的細菌細胞有一定的保護作用。如對含鹽量較高的食品(如醬油)進行稀釋,可以采用滅菌蒸餾水。


 

(二)傾注培養

 


1、操作方法

(1)根據標準要求或對污染情況的估計,選擇1~3個適宜稀釋度,分別在制10倍遞增稀釋的同時,以吸取該稀釋度的吸管移取1mL稀釋液于滅菌平皿中,每個稀釋度做兩個平皿。

(2)將涼至48℃平板計數瓊脂培養基注入平皿約15mL,并轉動平皿,混合均勻。同時將平板計數瓊脂培養基傾入加有1mL稀釋液(不含樣品)的滅菌平皿內作空白對照。

(3)待瓊脂凝固后,翻轉平板,置36±1℃溫箱內培養48±2h,取出計算平板內菌落數目,乘以稀釋倍數,即得每克(每毫升)樣品所含菌落總數。 

(4)傾注用培養基應在48℃水浴內保溫,溫度過高會影響細菌生長,過低瓊脂易于凝因而不能與菌液充分混勻。如無水浴,應以皮膚感受較熱而不燙為宜。

傾注培養基的量規定不一,從12~20mL不等,一般以15mL較為適宜,平板過厚可影響觀察,太薄又易于干裂。傾注時,培基底部如有沉淀物,應將底部棄去,以免與菌落混淆而影響計數觀察

(5)為使菌落能在平板上均勻分布,檢液加入平皿后,應盡快傾注培養基并旋轉混勻,可正反兩個方向旋轉,檢樣從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用時間不宜超過20min,以防止細菌有所死亡或繁殖。

(6)溫較低,故多采用30℃。培養時間一般為48h,有些方法只要求24h的培養即可計數。培養箱應保持一定的濕度,瓊脂平板培養48h后,培養基失重不應超過15%。

(7)為了避免食品中的微小顆粒或培基中的雜質與細菌菌落發生混淆,不易分辨,可同時作一稀釋液與瓊脂培養基混合的平板,不經培養,而于4℃環境中放置,以便計數時作對照觀察。

在某些場合,為了防止食品顆粒與菌落混淆不清,可在營養瓊脂中加入氯化三苯四氮唑(TTC),培養后菌落呈紅色,易于分別。


 

(三)計數和報告

 


1、操作方法

培養到時間后,計數每個平板上的菌落數。可用肉眼觀察,必要時用放大鏡檢查,以防遺漏。在記下各平板的菌落總數后,求出同稀釋度的各平板平均菌落數,計算出原始樣品中每克(或每mL)中的菌落數,進行報告。

2、計數

到達規定培養時間,應立即計數。如果不能立即計數,應將平板放置于0-4℃,但不得超過24h。

3、稀釋度選擇及菌落數報告方式

(1)若只有一個稀釋度平板上的菌落數在適宜計數范圍內,計算兩個平板菌落數的平均值,再將平均值乘以相應稀釋倍數,作為每克(或毫升)中菌落總數結果。

(2)若有兩個連續稀釋度的平板菌落數在適宜計數范圍內時,按式(l)計算:

N=∑C/(n1+0.1n2)d……………………(1)

式中:
N―樣品中菌落數;
∑C―平板(含適宜范圍菌落數的平板)菌落數之和;
n 1―第一個適宜稀釋度接種平板個數
n2―第二個適宜稀釋度接種平板個數;
d―稀釋因子(第一稀釋度)。

(3)若所有稀釋度的平板上菌落數均大于300,則對稀釋度最高的平板進行計數,其他平板可記錄為多不可計,結果按平均菌落數乘以最高稀釋倍數計算。

(4)若所有稀釋度的平板菌落數均小于30,則應按稀釋度低的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。

(5)若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長,則以小于1乘以低稀釋倍數計算。

(6)若所有稀釋度的平板菌落數均不在30~300之間,其中一部分小于30或大于300時,則以接近30或300的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。

4、菌落總數的報告
(1)菌落數在100以內時,按“四舍五人"原則修約,采用兩位有效數字報告。 

(2)大于或等于100時,第三位數字采用“四舍五人"原則修約后,取前兩位數字,后面用0代替位數;也可用10的指數形式來表示,按“四舍五入"原則修約后,采用兩位有效數字。

(3)若所有平板上為蔓延菌落而無法計數,則報告菌落蔓延。

(4)若空白對照上有菌落生長,則此次檢測結果無效。

(5)稱重取樣以CFU/g為單位報告,體積取樣以CFU/mL 為單位報告。


 

(四)特別注意

 


1、不同稀釋度的菌落數應與稀釋倍數成反比(同一稀釋度的二個平板的菌落數應基本接近),即稀釋倍數愈高菌落數愈少,稀釋倍數愈低菌落數愈多。如出現逆反現象,則應視為檢驗中的差錯(有的食品有時可能出現逆反現象,如酸性飲料等),不應作為檢樣計數報告的依據。

2、當平板上有鏈狀菌落生長時,如呈鏈狀生長的菌落之間無任何明顯界限,則應作為一個菌落計,如存在有幾條不同來源的鏈,則每條鏈均應按一個菌落計算,不要把鏈上生長的每一個菌落分開計數。如有片狀菌落生長,該平板一般不宜采用,如片狀菌落不到平板一半,而另一半又分布均勻,則可以半個平板的菌落數乘2代表全平板的菌落數。

3、當計數平板內的菌落數過多(即所有稀釋度均大于300時),但分布很均勻,可取平板的一半或1/4計數。再乘以相應稀釋倍數作為該平板的菌落數。


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